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Resumo

Aqui, descrevemos um método inovador para determinar os polimorfismos do comprimento do receptor 1 (CR1) do complemento para uso em várias aplicações, particularmente a avaliação da susceptibilidade a doenças como a doença de Alzheimer (AD). Este método poderia ser útil para entender melhor o papel das isoformas CR1 na patogênese da AD.

Resumo

O receptor de complemento 1 (CR1), uma glicoproteína transmembranar que desempenha um papel fundamental no sistema imune inato, é expressa em muitos tipos de células, mas especialmente em glóbulos vermelhos (RBCs). Como receptor para os componentes do complemento C3b e C4b, o CR1 regula a ativação da cascata do complemento e promove a fagocitose dos complexos imunes e detritos celulares, bem como o péptido amilóide-beta (Aβ) na doença de Alzheimer (AD). Vários estudos confirmaram polimorfismos de nucleotídeos únicos associados a AD (SNPs), bem como uma variação de número de cópias (CNV) no gene CR1 . Aqui, descrevemos um método inovador para determinar o polimorfismo do comprimento do receptor CR1. O receptor inclui três domínios, chamados repetições homólogas longas (LHR) -LHR-A, LHR-C e LHR-D-e um n domínio, LHR-B, onde n é um número inteiro entre 0 e 3. Usando um único par De iniciadores específicos, o material genético é usado para amplificar um primeiro fragmento do domínio LHR-B (thE variante amplicão B) e um segundo fragmento do domínio LHR-C (o amplicão invariante). O variante amplicão B e o amplicão invariante exibem diferenças em cinco nucleótidos fora das áreas de hibridação dos referidos iniciadores. O número de amplicões variantes B e de amplicões invariantes é deduzido usando uma ferramenta quantitativa (curvas de fusão de alta resolução (HRM)), e a proporção do amplicão variante B para o amplicão invariante difere de acordo com o polimorfismo do comprimento CR1. Este método fornece várias vantagens em relação ao método do fenótipo canônico, pois não requer material fresco e é mais barato, mais rápido e, portanto, aplicável a populações maiores. Assim, o uso deste método deve ser útil para entender melhor o papel das isoformas CR1 na patogênese de doenças, como AD.

Introdução

AD, a causa mais comum de demência, afeta mais de 30 milhões de pessoas em todo o mundo e é um grande problema de saúde pública 1 . Clinicamente, AD caracteriza-se por distúrbios neurocognitivos que levam a uma progressiva perda de autonomia 2 . AD caracteriza-se por duas características neuropatológicas, nomeadamente, depósitos de amilóides extracelulares e emaranhados neurofibrilares intracelulares 3 .

Tradicionalmente, de acordo com a idade de início da doença, AD é classificada em duas formas. Primeiro é AD inicial (EOAD), onde o início ocorre com mais freqüência antes dos 65 anos; Este formulário representa menos de 5% dos casos de AD. É uma forma rara, autossômica-dominante de AD, que resulta em mutações totalmente penetrantes na proteína precursora amilóide ( APP) 4 , na presenilina 1 ( PSEN1 ) 5 ou na presenilina 2 ( PSEN2 )> 6 genes. Em segundo lugar, a forma mais comum da doença (> 90% dos casos de AD) é chamada de "início esporádico" de início tardio (LOAD) e a maioria das vezes ocorre em indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos. Isso resulta de múltiplos fatores de risco genéticos e ambientais 7 . Em LOAD, o alelo 4 do gene apolipoproteína E ( APOE ) é o principal fator de risco genético 8 , 9 . Além disso, mais de 20 loci de genes foram identificados por estudos de associação de genoma (GWAS) como associados ao risco de AD, um dos quais sendo o gene 10 do receptor 1 ( CR1 ) do componente do complemento, localizado em Cromossomo 1q32 em um conjunto de proteínas relacionadas ao complemento. O gene CR1 codifica a proteína do receptor do complemento tipo 1 (CR1), um componente dos reguladores da atividade do complemento.

CR1 (o receptor C3b / C4b, CD35), uma glicoproteína transmembranar de aproximaçãoEly 200 kDa 11 , liga-se ao C3b, C4b, C3bi, C1q, lectina de ligação de manano (MBL) e proteínas de complemento de ficolina 12 . A função biológica do CR1 varia com os tipos de células em que é expresso. Nos seres humanos, 90% da CR1 circulante total é encontrada nos glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos) 13 . Presente na superfície dos glóbulos vermelhos, CR1 se liga aos microrganismos opsonizados com C3b ou C4b ou complexos imunes, facilitando a depuração da circulação. Os complexos ligados ao CR1 são de fato transferidos para fagócitos quando os glóbulos vermelhos atravessam o fígado e o baço 11 , 14 . Ao limitar a deposição de C3b e C4b, o CR1 pode impedir a ativação excessiva do complemento. Portanto, a expressão de CR1 em glóbulos vermelhos é considerada um elemento essencial na proteção de tecidos, como o sistema nervoso cerebral, contra a deposição do complexo imune e as doenças resultantes. O CR1 em RBCs também é conhecido porDesempenham um papel importante na infecção patogênica 15 , 16 . Além disso, o CR1, como jogador-chave na imunidade inata, está envolvido na regulação da cascata do complemento e no transporte e remoção de complexos imunes. O CR1 exerce essa atividade unindo fragmentos C3b e C4b e dissociando conversases clássicas e alternativas (dissociação de C2a do complexo C4b2a e dissociação de C3b do complexo C3bBb). Como cofator do fator de serina-protease de plasma I (FI), o CR1 inibe as vias de complemento clássico e alternativo, aumentando a clivagem de C4b e C3b por FI, uma propriedade conhecida como atividade de cofator (CA) e inibindo o ciclo de amplificação C3 , Por sua vez, impedindo a ativação adicional do complemento. Rogers e colegas fornecem evidências de que o péptido Aβ pode ligar e ativar a via do complemento na ausência de anticorpos 17 e sugerir que o péptido Aβ é clOriunda da circulação através da aderência dependente do complemento ao CR1 expresso em glóbulos vermelhos 18 .

O CR1 exibe três tipos de polimorfismos: polimorfismos estruturais ou de comprimento, polimorfismos de densidade e polimorfismos do grupo sanguíneo Knops 11 , 19 . O polimorfismo estrutural está relacionado a uma variação no número de repetições homólogas longas (LHRs) e, portanto, define quatro isoformas. De fato, o domínio extracelular da proteína CR1 é composto de uma série de unidades repetitivas, chamadas repetições de consenso curto (SCRs) ou repetições de controle de complemento (CCPs). Estes SCRs foram demonstrados a partir do ácido desoxirribonucleico do complemento (cDNA) que codifica CR1. Os SCRs são organizados em grupos em tandem de sete, conhecidos como LHRs. CR1 é organizado em quatro LHRs, designados como LHR-A, -B, -C e -D, decorrentes da duplicação de uma unidade sete-SCR 19 , 20 ,21 .

Em ordem crescente de frequência, estas isoformas CR1 determinadas por Western blot (WB) são CR1 * 1 (A / F) (migração rápida na eletroforese em gel), CR1 * 2 (B / S) (migração lenta na eletroforese em gel), CR1 * 3 (C / F`) e CR1 * 4 (D). As duas isoformas mais comuns, CR1 * 1 (A / F) e CR1 * 2 (B / S), são compostas por quatro e cinco LHRs, respectivamente, enquanto CR1 * 3 (C / F`) e CR1 * 4 (D ) São compostos por 3 e 6 LHRs, respectivamente. A isoforma mais comum (CR1 * 1), composta por 30 SCRs, contém três sites de ligação C4b (SCR 1-3, 8-10 e 15-17) e dois sites de ligação C3b (SCRs 8-10 e 15-17) , Enquanto os SCRs 22-28 ligam C1q, ficolins e MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Assim, CR1 * 2 contém um site de ligação C3b / C4b adicional comparávelD para CR1 * 1. A Figura 1 ilustra as estruturas, nomenclaturas e pesos moleculares das quatro isoformas diferentes de CR1.

O polimorfismo de densidade corresponde a um fenótipo estável que representa o nível de expressão constitutiva de CR1 em glóbulos vermelhos. Em indivíduos caucasianos saudáveis, demonstrou-se que o número de moléculas CR1 por RBC pode variar até um fator de dez (variando de 150 a 1.200 moléculas por célula) 26 . Os glóbulos vermelhos do fenótipo de Helgeson apresentam uma densidade de CR1 muito baixa, que mostrou ser inferior a 150 moléculas por célula 27 , 28 . A densidade de CR1 em glóbulos vermelhos está associada geneticamente a um sistema bialélico com codoma autossômico no gene CR1 , correlacionado com um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição Hin dIII (RFLP) 29 . Uma mutação de ponto único no Intron 27 do gene CR1, entre os exões que codificam o segundoSCR em LHR-D, resulta na geração de um local polimórfico Hin dIII nesta região 30 . Os fragmentos genómicos de Hin dIII de 7,4 e 6,9 ​​kDa identificam os alelos associados com a densidade alta (H alelo) ou baixa (alelo L) CR1 em RBCs, respectivamente. No entanto, não foi encontrada correlação entre a densidade de CR1 em glóbulos vermelhos e polimorfismos de Hin dIII em algumas populações da África Ocidental 31 , 32 . O mecanismo que liga a regulação da densidade CR1 a um polimorfismo Hin dIII não codificante permanece desconhecido. Entre vários polimorfismos, Q981H em SCR16 e P1786R em SCR28 foram relatados como ligados à densidade CR1 em RBCs 30 , 33 .

O polimorfismo Knops (KN), de acordo com a nomenclatura internacional, é o 22º sistema do grupo sanguíneo a ser indexado pela Sociedade Internacional de Transfusão de Sangue. Contém 9 espécimes antigênicosFicções expressadas pelo CR1 em glóbulos vermelhos, incluindo três pares antigênicos antitêmicos, KN1 / KN2, KN3 / KN6 e KN4 / KN7, bem como 3 antígenos isolados, KN5, KN8, KN9. Os antígenos KN1, KN3, KN4 e KN5 são antígenos de alta freqüência do sistema KN ( ou seja, expressos em mais de 99% da população em geral). No entanto, o papel deste polimorfismo em AD ainda deve ser determinado 13 .

O protocolo descrito neste trabalho foi projetado para determinar os genótipos de polimorfismo de comprimento CR1 envolvidos na susceptibilidade a várias doenças, como AD, lúpus eritematoso sistêmico e malária. Nosso método para a determinação do polimorfismo do comprimento CR1 aproveita o número de LHR-Bs compreendendo as isoformas CR1 e as diferenças de seqüência entre LHR-B e LHR-C ( Figura 2 ).

Protocolo

O protocolo para coleta e manuseio de sangue humano foi revisado e aprovado pelo comitê de ética regional (CPP Est II) e o número do protocolo é 2011-A00594-37.

NOTA: O protocolo a seguir descreve o tratamento do sangue humano. Siga as diretrizes institucionais ao descartar material biológico perigoso. Devem ser usados ​​equipamentos de segurança de laboratório, como coletes de laboratório e luvas. Um gráfico de fluxo descrevendo o protocolo é exibido na Figura 3 .

1. Extração de sangue e fluido de fluido corporal

  1. Pipetar 20 μL de proteinase K (15 μg / μL) no fundo de um tubo de 1,5 mL.
  2. Adicione 200 μL de amostra ao tubo de 1,5 mL. Use até 200 μL de sangue total, plasma, soro, revestimento buffy ou fluidos corporais, ou até 5 x 10 6 linfócitos em 200 μL de PBS.
  3. Adicione 200 μL de tampão de lise à amostra. Misture por pulso-vortexing por 15 s.
  4. Incubar a 56 ° C durante 10 min num banho de água.
  5. Centrifugue brevemente o tubo de 1,5 mL para remover as gotas do interior da tampa.
  6. Adicione 200 μL de etanol (96-100%) à amostra e misture novamente por pulso-vortexing por 15 s. Após a mistura, centrifugue brevemente o tubo de 1,5 mL para remover as gotas do interior da tampa.
  7. Aplicar cuidadosamente a mistura do passo 1.6 à coluna da membrana (em um tubo de coleta de 2 mL). Sem molhar a jante, feche a tampa e centrifugue a 6.000 xg durante 1 min. Coloque a coluna de membrana em um tubo de coleta limpo de 2 mL e descarte o tubo que contém o filtrado.
  8. Abra cuidadosamente a coluna de membrana e adicione 500 μL de tampão de lavagem 1 sem molhar a jante. Feche a tampa e centrifugue a 6.000 xg durante 1 min. Coloque a coluna de membrana em um tubo de coleta limpo de 2 mL e descarte o tubo que contém o filtrado.
  9. Abra cuidadosamente a coluna da membrana e adicione 500 μL de tampão de lavagem 2 sem molharE rim. Feche a tampa e centrifugue a toda velocidade (20.000 xg) por 3 min.
  10. Coloque a coluna de membrana em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte o tubo de coleta com o filtrado. Centrifugar a 20,000 xg durante 1 min.
  11. Coloque a coluna de membrana em um tubo limpo de 1,5 mL e descarte o tubo de coleta contendo o filtrado.
  12. Abra cuidadosamente a coluna da membrana e adicione 200 μL de água destilada. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e depois centrifugar a 6.000 xg durante 1 min.
  13. Proceder à determinação do passo de concentração do DNA ou congelar as amostras de DNA a -20 ° C

2. Determinação da concentração de DNA

NOTA: veja a Figura 4 .

  1. Pressione 1 para selecionar o modo de DNA em um espectrofotômetro. Selecione um comprimento de caminho de 5 mm usando as setas esquerda e direita. Selecione um fator de diluição de 1 usando as setas esquerda e direita.
  2. Selecione a unidade (μg / mL) usando oE setas esquerda e direita. Selecione um fator de 50 usando as setas esquerda e direita. Pressione OK .
  3. Pipetar 10 μL de água destilada na cuvete. Coloque a cuvete no espectrofotômetro. Pressione o botão OA / 100% T.
  4. Pipetar 10 μL da amostra de DNA (diluição 1/4 em água destilada) na cuvete. Coloque a cuvete no espectrofotômetro. Pressione o botão verde (ler / iniciar). Observe a concentração.
  5. Congele a amostra de DNA a -20 ° C.

3. Protocolo HRM-PCR

  1. Descongelar as amostras de DNA. Diluir as amostras de DNA em tubos de 1,5 mL com água para ajustá-los a uma concentração de 10 ng / μL
    NOTA: O volume total de DNA diluído deve estar entre 2 μL e 10 μL.
  2. Descongelar as soluções de primer. Diluir as soluções de primário em tubos de 1,5 mL com água para ajustá-los à mesma concentração de 6 μM.
    NOTA: As sequências de iniciadores e as condições de reação são fornecidas em T1.

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Tabela 1: Primers e parâmetros utilizados na análise de derretimento de alta resolução.

  1. Descongelar as soluções do kit HRM-PCR e misturar cuidadosamente com vortex para assegurar a recuperação de todos os conteúdos. Resumidamente girar os três frascos contendo a mistura enzimática com corante de ligao ao ADN, MgCl2, e água numa microcentrífuga antes de abri-los. Armazene-os à temperatura ambiente.
  2. Em um tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente, prepare a mistura de PCR para uma reação de 20 μL adicionando os seguintes componentes na ordem abaixo:
    1. 10 μL de mistura enzimática com corante de ligação a ADN;
    2. 2 uL de 25 mM de MgCl2;
    3. 1 μL de iniciador 1, 6 μM (concentração final: 300 nM);
    4. 1 μL de iniciador 2, 6 μM (concentração final: 300NM); e
    5. 5 μL de água.
      NOTA: Para preparar a mistura de PCR para mais de uma reação, multiplique os volumes acima pelo número de reações a serem executadas, além de uma reação adicional.
  3. Misture cuidadosamente com vortex.
  4. Pipetar 19 μL de mistura de PCR, preparada acima, em cada poço de uma placa de multiposição branca.
  5. Adicione 1 μL de modelo de DNA ajustado a concentração, preparado no passo 3.1.
    NOTA: Para as reações de controle, execute sempre um controle negativo com as amostras. Para preparar um controle negativo, substitua o DNA modelo com água.
  6. Selar a placa de multi-espaçoso branco com papel de vedação.
  7. Coloque a placa de multiplaca branca na centrífuga e equilibre-a com um contrapeso adequado ( ou seja, outra placa multi-poente). Centrifugação por 1 min a 1.500 xg em uma centrífuga balde balde padrão que contenha um rotor para placas de multiposição com adaptadores adequados.
  8. Carregue a placa de multi-ondas branca no instrumento HRM-PCR.
  9. Comece o programa HRM-PCR com as seguintes condições de PCR:

    Desnaturação: 95 ° C durante 10 min; 1 ciclo.
    Amplificação: 95 ° C durante 10 s, 62 ° C durante 15s e 72 ° C durante 20s; 47 ciclos.
    Curva de fusão: 95 ° C; Taxa de rampa: 0,02 ° C / s; 25 aquisições por ° C; 1 ciclo.
    Arrefecimento: 40 ° C por 30 s; Taxa de rampa 2,2 ° C / s; 1 ciclo.

4. Análise HRM para determinar o polimorfismo do comprimento CR1

NOTA: A metodologia descrita ( Figura 5 ) é específica para o nosso software (veja a Tabela de Materiais ), embora outros pacotes de software possam ser usados.

  1. Abra um software de varredura de genes para executar a análise de varredura de polimorfismo de comprimento CR1.
  2. Abra o experimento contendo o programa de amplificação e o programa de curva de fusão.
  3. Clique em Editor de amostra na barra do módulo e selecione o SFluxo de trabalho em conserva .
  4. Defina as propriedades das amostras ( ou seja, nome, controle desconhecido ou negativo).
  5. Clique em Análise na barra do módulo .
  6. Na lista Criar Nova Análise , selecione Gene Scanning.
  7. Clique na guia Normalização para normalizar as curvas de fusão.
  8. Clique na guia Mudança de temperatura para redefinir o eixo da temperatura (eixo dos x) das curvas de fusão.
    NOTA: O gráfico inferior mostra as curvas de fusão que são normalizadas e deslocadas pela temperatura.
  9. Clique no botão Calcular para analisar os resultados e determinar o agrupamento.
  10. Clique na guia Diferença do gráfico na área de gráficos para visualizar as Curvas de Fusão Normalizadas e Deslocadas e a Trama de Diferença com Deslocamento Normalizado e Temperatura .

Resultados

A Figura 6 A exibe a fenotipagem do polimorfismo do comprimento CR1 pela WB. A Figura 6 B e C exibe as curvas que são obtidas durante a análise HRM-PCR, permitindo a determinação do polimorfismo do comprimento CR1. A análise das curvas de fusão utilizando o software após a fusão de alta resolução dos amplicões derivados de PCR do DNA genômico de indivíduos com diferentes isoformas de CR1 produz curvas que discriminam sujeitos de acordo com seus fenótipos de expressão de CR1 alotípicos.

A Figura 6 B exibe um primeiro modo de apresentação, denominado "Curvas de fusão normalizadas e deslocadas", enquanto a Figura 6 C exibe um segundo modo de apresentação, denominado "Parcela de Diferença Normalizada e com Mudança de Temp."

Os perfis das curvas são distribuídos de acordo com os grupos que representam os fenótipos exibidos na Figura 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; E (CR1 * 2, CR1 * 4). Isso permite a genotipagem do polimorfismo de comprimento CR1 usando este novo método de biologia molecular.

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Figura 1: Representação esquemática da estrutura e polimorfismos da proteína do receptor 1 do complemento. Cada repetição de consenso curto (SCR) ou proteína de controle do complemento (CCP) é representada por um círculo. Os SCRs são agrupados em estruturas repetitivas e de ordem superior chamadas LHRs. Do domínio extracelular à membrana celular, os LHRs são: LHR-A, -B, -C, -D e -S (LHR suplementar ou adicional). Na isoforma CR1 mais comum(CR1 * 1), o site de ligação da atividade de aceleração C4b / decadência (DAA) está localizado em LHR-A (SCRs 1-3, círculos verdes), o site de ligação da atividade C3b / C4b / cofactor (CA) está localizado no 3 SCRs N-terminais de LHR-B (SCRs 8-10, círculos vermelhos) e LHR-C (SCRs 15-17, círculos roxos) e o local de ligação para C1q / MBL e ficolin é encontrado no LHR-D (SCRs 22-28, círculos azuis). As estruturas homólogas são coloridas de forma idêntica. A isoforma CR1 * 2 (S) apresenta um LHR adicional (LHR-S) e, portanto, contém um site de ligação C3b / C4b adicional. KDa, kilodalton. NRC, condições não reduzidas. RC, condições reduzidas. TM, domínio transmembranar. Esta figura foi adaptada de Brouwers et al. 36 com permissão do Nature Publishing Group. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Figura 2 : Representação esquemática da estrutura da isoforma CR1 com posições de amplicão de seqüência obtidas pela HRM-PCR. Cada caixa representa um SCR. Os SCRs são agrupados em LHRs: LHR-A, -B, -C e -D. As estruturas homólogas são coloridas de forma idêntica. As isoformas CR1 * 2 e CR1 * 4 apresentam LHRs adicionais (LHR-B) e, portanto, contêm uma área de amplicão adicional (amplicão B, em vermelho). CR1 * 3 não possui LHR-B e contém menos área de amplicão (sem amplicão B). As diferenças de nucleótidos entre o amplicão B (196 pb) e o amplicão invariante (197 pb) são retratadas em vermelho e azul, respectivamente. As diferenças na proporção: (amplicão B, em amplicão vermelho / invariante, em azul) entre cada isoforma CR1 são determinadas pela HRM-PCR, permitindo a genotipagem. As sequências de iniciadores CN3 e CN3re são sublinhadas. TM, domínio transmembranar. CYT, cauda citoplasmática.Pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 3: Diagrama de fluxo do protocolo para genotipagem do polimorfismo do comprimento CR1 a partir de amostras de sangue humano. Coletar uma amostra de DNA humano. Extraia o DNA para obter uma amostra de sangue de DNA. Determine a concentração de DNA e diluir para obter a concentração de DNA a 10 ng / μL. Use HRM-PCR para obter o genótipo de polimorfismo de comprimento CR1. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Figura 4 : Capturas de tela do espectrofotômetro nós Para determinar a concentração de DNA. Pressione 1 ( A ) para selecionar o modo de DNA no espectrofotômetro. Selecione um comprimento de caminho de 5 mm ( B ) usando as setas esquerda e direita ( C ). Selecione a unidade (μg / mL) ( D ) usando as setas esquerda e direita ( C ). Selecione o fator de diluição 1 ( E ) usando as setas esquerda e direita ( C ). Selecione um fator de 50 ( F ) usando as setas esquerda e direita. Pressione OK ( G ). Pipetar 10 μL de água destilada na cuvete. Coloque a cuvete no espectrofotômetro ( H ). Pressione o botão OA / 100% T ( I ). Pipetar 10 μL de amostra de DNA (diluição 1/4 em água destilada) na cuvete. Coloque a cuvete no espectrofotômetro ( K ). Pressione o botão verde (ler / iniciar) ( L ). Observe a concentração ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Capturas de tela da interface gráfica do software usado na etapa 4 do protocolo. ( A ) Abra o software de varredura de genes. ( B ) Programa de amplificação e programa de curva de fusão. ( C ) Clique no editor de exemplo na barra do módulo . ( D ) Selecione Digitalização . ( E ) Definir as propriedades das amostras. ( F ) Clique em Análise na barra do módulo . ( G ) Clique na guia Normalização para normalizar as curvas de fusão. ( H ) Clique na guia Mudança de temperatura para mostrar as curvas de fusão que são ambasNormalizado e com mudança de temperatura. ( I ) Clique no botão Calcular para analisar os resultados e determinar o agrupamento. ( J ) Clique na aba da parcela Diferença para visualizar as Curvas de Fusão Normalizadas e Deslocadas e a Trama de Diferença com Deslocamento Normalizado e com Temperatura . ( K ) Agrupamento colorido das amostras de acordo com os genótipos de comprimento CR1. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Figura 6: Fenotipagem dos polimorfismos de comprimento CR1 observados na WB e suas correspondentes curvas de perfil obtidas pela HRM-PCR. ( A ) Fenotipagem dos polimorfismos de comprimento CR1 usando WB. ( B ) e ( C ) Genotipagem de polimorfismos de comprimento de CR1 usando análise de HRM-PCR. A análise da curva HRM de amplicões de PCR obtidos a partir do DNA genômico de indivíduos que exibem diferentes isoformas CR1 levou à identificação de perfis de curva específicos: (CR1 * 3, CR1 * 1) (roxo); (CR1 * 1, CR1 * 2) (azul); CR1 * 1 (verde); CR1 * 2 (vermelho); E (CR1 * 2, CR1 * 4) (cinza). Estes correspondem aos alelos de polimorfismo de comprimento CR1. Conforme mostrado pelos dois modos de apresentação - "Curvas de fusão normalizadas e deslocadas" (B) e "Parcela de diferença normalizada e temporizada" (C) - os perfis de curva são distribuídos de acordo com o (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; E (CR1 * 2, CR1 * 4) grupos. Esta figura foi adaptada de Mahmoudi et al. 38 com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Discussão

Aqui, descrevemos uma metodologia amplamente acessível para estudar polimorfismos de comprimento CR1. As técnicas de biologia molecular para amplificação ou hibridação segmentar nunca foram capazes de dar resultados satisfatórios que permitem a determinação de polimorfismos de comprimento CR1 em todos os indivíduos. Isto é devido à estrutura repetitiva do gene CR1 ( ou seja, os SCR altamente repetitivos de CR1). O método de biologia molecular descrito aqui explora a distribuição quantitativa de LHR-B na molécula CR1. A molécula CR1 inclui n domínios LHR-B, onde n é um número entre 0 e 3, e apenas um domínio LHR-C, conforme descrito e ilustrado na Figura 2 . A detecção quantitativa de domínio B permite discriminar perfeitamente um domínio adicional ou ausente B.

A partir do material genético extraído, um primeiro fragmento de DNA de LHR-B é amplificado por PCR usando um único par de iniciadores específicos, representandoUma variante característica de LHR-B chamada "variante amplicão B." Um outro fragmento de DNA, chamado "amplicon invariante" e pertencente ao LHR-C, também é amplificado. Este segundo fragmento de DNA é um fragmento de LHR-C, mas também pode ser usado outro fragmento invariante de LHR-A ou -D.

Os dois fragmentos de DNA, amplicão variante B e o amplicão invariante, são amplificados pelos mesmos iniciadores e apresentam cinco diferenças nas sequências de nucleótidos. Esta característica torna possível no passo subseqüente determinar o número de variantes de amplicão B e o número de amplicões invariantes usando uma ferramenta de biologia molecular quantitativa, HRM, que foi adaptada para este propósito. A relação entre o número de amplicão B e o amplicão invariante (proporção: amplicão B / amplicão invariante) varia de acordo com o comprimento da molécula CR1. De fato, CR1 * 4 exibe 3 unidades de amplicão B para 1 amplicão invariante, CR1 * 2 exibe 2 unidades de amplicão B para 1 amplicão invariante, CR1 * 1 exibe 1 amplicão B a 1 amplicon invariante e CR1 * 3 exibe 0 unidades Amplicon B para 1 amplicão invariante ( Figura 2 ). Assim, este método HRM-PCR permite a genotipagem do polimorfismo de comprimento CR1.

No entanto, no início do estudo, esta técnica requer o uso de sujeitos de referência cujos fenótipos CR1 já são conhecidos ( ou seja, previamente estabelecidos pela WB) para poder estabelecer a genotipagem de CR1 de acordo com o perfil de referência das curvas obtidas Por HRM-PCR. São disponíveis dois tipos de representação, nomeadamente, "Curvas de fusão normalizadas e desviadas" e "Parcela de diferença normalizada e temporizada". Eles exibem grupos distintos de perfis de curva coloridos de acordo com a fenotipagem de polimorfismo de comprimento CR1 obtida pela WB ( Figura 6 ). A partir do passo "Normalized and Shifted Melting Curves", nosso método possibilita discriminarE distintos grupos de curvas correspondentes às isoformas de CR1, agrupadas por cor. No entanto, o "Traçado de Diferença com Diferença Temp.", Que corresponde a uma representação matemática diferente, permite a visualização mais fácil dos distintos grupos de curvas. Embora o software do fabricante tenha sido rotineiramente utilizado neste estudo, outros softwares (como uANALYSE) podem ser usados ​​como um programa de extração de dados para análise de curva.

Até à data, a técnica de análise WB é a técnica original que permite a identificação dos diferentes polimorfismos de comprimento CR1 ao nível da proteína. No entanto, esta técnica tem uma série de desvantagens. Em particular, a análise de proteínas por WB só pode ser feita após a extração das membranas celulares. Como resultado, é complexo e muito demorado. Além disso, esta técnica requer a obtenção de uma amostra de sangue fresco em condições apropriadas no início do procedimento para obter res útilUlts. Pelo contrário, HRM-PCR realizada em DNA possibilita a utilização de manchas ou amostras de sangue seco após o armazenamento a longo prazo. HMR-PCR requer um instrumento de fusão de DNA especializado, seja um instrumento dedicado ou um termociclador de capacidade HMR com software HRM. A detecção de SNP depende de vários fatores: i) SNPs incluídos em grandes fragmentos de PCR são mais difíceis de detectar do que os mesmos SNP em pequenos fragmentos de PCR; Ii) SNPs pertencentes às classes III e IV são mais difíceis de detectar do que os das classes I e II 34 ; E iii) SNPs que estão flanqueados pela simetria de base do vizinho mais próximo ( por exemplo, 5'-G (G / C) C-3 ') não podem ser classificados por derretimento, independentemente da potência de resolução da plataforma HMR. Pode ser útil testar os fragmentos de PCR previstos que contêm o SNP de interesse com o software uMELT 35 para avaliar a validade do ensaio. Finalmente, o HMR-PCR é um método analógico, o que significa que a semelhança das curvas de fusão apostaUma referência e um modelo não implica necessariamente que a sequência do modelo seja idêntica à referência, uma vez que a sequência do modelo pode ser diferente da referência mas equivalente termodinamicamente. No entanto, essas limitações não se aplicam ao método descrito aqui, que se baseia na fusão de uma mistura de amplicões que diferem em termos de 5 seqüências de nucleotídeos.

Além disso, a técnica descrita aqui, com base na análise de HRM, tem muitas vantagens. Primeiro, os polimorfismos do comprimento CR1 são determinados mais rapidamente, uma vez que os resultados são obtidos em cerca de 2 h, uma vez que a extração do material genético foi realizada. Por outro lado, as técnicas bioquímicas tradicionais baseadas na análise da proteína WB requerem etapas que são relativamente longas: a eletroforese de extratos de membrana celular através de um gel de acrilamida, um passo para transferir proteínas para uma membrana de nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno (PVDF) e um passo para identificar a Isoformas doMolécula CR1 por imunoquimioluminiscência. Em segundo lugar, a técnica HRM-PCR também tem a vantagem de não ser muito cara, o que é particularmente importante para um método que provavelmente será aplicado a muitos indivíduos ( ou seja, grande escala) para determinar sua susceptibilidade ao desenvolvimento de patologias como a doença de Alzheimer, Lúpus ou malária.

Recentemente, nós e outros mostraram que a isoforma CR1 * 2, que contém um site de ligação C3b / C4b adicional, foi associada à AD 36 , 37 , 38 . Em nosso estudo publicado anteriormente, os polimorfismos do comprimento CR1 ao nível do gene e da proteína foram consistentes em 98,9% dos indivíduos 38 . Os resultados discordantes obtidos ao comparar os polimorfismos de comprimento obtidos pela HRM-PCR com os obtidos por WB corresponderam a indivíduos com um perfil de genótipo (CR1 * 1, CR1 * 2) determinado pelo HRM (gene), mas exPressionando apenas a isoforma CR1 * 1 na superfície do eritrócito de acordo com a WB (proteína). Em nosso estudo, a falta de expressão de isoforma de CR1 * 2 (indivíduos portadores de um alelo silencioso) foi reproduzível quando o WB foi realizado com um tempo de exposição mais longo e poderia ser explicado pela existência de um alelo CR1 silencioso (CR1 * 2), descrito Na literatura de Helgeson 39 . No entanto, estudos adicionais sobre populações maiores são necessários para apoiar esta hipótese.

Deve-se notar que SNPs particulares (SNPs apenas ocorrendo em um pequeno grupo familiar ou mesmo em um único indivíduo) levaram a perfis de curva distintos que deveriam ser decifrados usando a determinação do fenótipo de referência (WB), mas que não pode ser confundido com o perfil canônico para evitar Qualquer interpretação errada do genótipo de polimorfismo de comprimento CR1.

Divulgações

Os autores são inventores de uma patente de propriedade da Universidade de Reims Champagne-Ardenne (URCA) (patente número WO 2015166194)

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros da Plateforme Régionale de Biologie Innovante, funcionários do Departamento de Imunologia e funcionários do Departamento de Medicina Interna e Geriatria, que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi financiado pelos Hospitais da Universidade de Reims (número de concessão AOL11UF9156). Agradecemos também a Fiona Ecarnot (EA3920, Hospital Universitário de Besancon, França) por assistência editorial.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
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SensiCareIce powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
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TipOne 10µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
ART 1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf QualityEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France51306DNA Extraction
Buffer ALQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19075Lysis buffer
QIAamp Mini Spin ColumnQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France1011706DNA binding
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Biowave DNA spectrophotometerBiochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England80-3004-70DNA concentration 
Mikro 200 centrifugeHettich Zentrifugen, D-78532, Germany0002020-02-00centrifugation
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4987000010distribution
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Heraeus Megafuge 11R centrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France75004412centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany05015278001high resolution melting polymerase chain reaction
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light cycler 480 SW 1.5.1 softwareRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germanysoftware used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgiumreaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgiumreaction reagent

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